一. 配制BSA标准品

注：标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。

BSA标准品配制可参照下表（微孔板检测，线性范围20-2000μg/ml）：

如用试管法检测，每管需加100μl标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300μl。

二. 配制BCA工作液

A. 计算所需要的总BCA工作液体积

总BCA工作液体积=（标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的BCA工作液

注意：试管法检测时每个样品加2.0ml BCA工作液，微孔板检测每个样品加200μl BCA工作液。

B. 配制BCA工作液

50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。

注意：BCA试剂B加入BCA试剂A中后，迅速浑浊，通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内，室温条件24h稳定。

三. 试管法

1. A-I的BSA标准品各取100μl依次加入到各反应管中。

2. 将待测样品适当稀释(可以多作几个梯度，如 2倍、4倍、8倍稀释)，不同稀释度的待测样品各取100μl依次加入到各反应管中。

3. 各管加入2.0ml BCA工作液，混匀，37℃孵育30min，冷却到室温。

注意：也可以室温放置2h，或60℃放置30min。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深，并且显色反应会因温度升高而加快。如果蛋白浓度较低，可在较高温度孵育，或延长孵育时间。

4. 在分光光度计上进行检测，设定波长为562nm，用装满水的比色皿对仪器校零，然后在10分钟内对所有BSA标准品和待测样品读数。

5. 绘制标准曲线，计算待测样品中的蛋白浓度。

注意：数据处理时需要去除明显错误的值, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。

四. 微孔板法

1. A-I的BSA标准品各取25μl依次加入到96孔板各孔中。

2. 将待测样品适当稀释(可以多作几个梯度，如 2倍、4倍、8倍稀释)，不同稀释度的待测样品各取25μl依次加入到96 孔板的样品孔中。

3. 各孔加入200μl BCA工作液，充分混匀，盖上微孔板，37℃孵育30min，冷却到室温。

注意：也可以室温放置2h，或60℃放置30min。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深，并且显色反应会因温度升高而加快。如果蛋白浓度较低，可在较高温度孵育，或延长孵育时间。

4. 用酶标仪测定每个待测样品和BSA标准品在A562处的吸光值，或540~590 nm之间的其它波长的吸光值，注意要减去空白孔的吸光值。

5. 绘制标准曲线，计算待测样品中的蛋白浓度。

注意：数据处理时需要去除明显错误的值, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。