1. 检测出的分子量与理论分子量有差异

1) 翻译后修饰，比如磷酸化，糖基化等， 这些变化会增加蛋白的大小。

2) 蛋白变性后复性引起的二聚体， 三聚体，四聚体等形式，分子量可能是单体形式的二倍，三倍，四倍等。

3) 蛋白活化后剪切，比如很多蛋白在合成的时候是作为前体蛋白合成的，然后剪切形成活性蛋白片段形式，实际分子量变小。

4) 蛋白的电泳表观分子量与理论分子量有差别，例如p53蛋白，其表观分子量是53kDa (这也是该蛋白名字的由来) ，但是根据氨基酸序列计算得到的分子量却是43kDa。

5) 许多蛋白质有多个亚型， 分子量都不同。

6) 可能是胶变形引起的，比对Marker出现偏差。

7) 蛋白质的降解。

2. Western blot结果中背景较高
可能的原因及建议：
1) 膜封闭不够
答：延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
2) 一抗稀释度不适宜
答：对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度，降低抗体浓度。
3) 一抗孵育的温度偏高
答：建议4℃结合过夜。
4) 检测时曝光时间过长
答：减少曝光时间。

3. Western blot结果中杂带较多
可能的原因及建议：
1) 目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
答：查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
2) 目的蛋白有其它剪切本
答：查阅文献或生物信息学分析可能性。
3) 样本处理过程中目的蛋白发生降解
答：加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
4) 上样量过高，太敏感
答：适当减少上样量。

5) 一抗或者二抗浓度偏高
答：降低抗体浓度。

4. Western blot结果中无信号或显示信号弱

可能的原因及建议：
1) 检测样本不表达目的蛋白
答：选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
2) 检测样本低表达目的蛋白
答：提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
3) 转移不完全或过转移
答：可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
4) 抗体不能识别测试种属的相关蛋白
答：购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
5) 一抗孵育时间不足
答：建议4℃结合过夜。
6) 二抗与一抗不匹配。
答：选择针对一抗来源的种属的抗体。

5. 问题：WB实验中的蛋白质条带强度不一致。

解析：蛋白质条带强度不一致可能是由于抗体和蛋白质结合效率不一致、蛋白质浓度不一致等原因造成的。要解决这个问题，可以调整抗体的浓度和反应的时间，优化蛋白质的提取和浓度测定方法。

6. 条带歪斜或漂移

如果可以排除电泳时条带已经歪斜，可能的原因是：1）“三明治”结构因为电转移装置长期使用，海绵垫变薄或操作时没有压紧，在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，导致电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，或者在电转移过程中膜或凝胶歪斜。2）电转移时转移液没有完全浸没凝胶和膜。

7. 转印的方法如何选择（半干还是湿转）

半干转操作步骤与湿转基本类似，区别在于转移电压和时间也有所不同。半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。

两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。

小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD 以上）建议湿转。

8. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

9. 内参抗体怎么选择

内参抗体应遵循的原则：

1) 样本种属来源：

首先考虑实验样本来源于何物种。

a. 哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β- actin、β- tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3等。

b. 其他稀少物种来源，可以参照文献指导或是选择高度保守管家基因表达的蛋白质相应的抗体作为内参。

2) 目的蛋白分子量：

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5 kDa以上但勿差距太大。比如目的蛋白分子量为45 kDa，此时不适宜选择β-actin作为内参，可以考虑选择GAPDH或者β- tubulin作为内参。

3) 目的蛋白表达部位：

针对一般蛋白质检测，GAPDH、β-actin或β-tubulin可以满足要求，而如果需要检测亚细胞器蛋白时，适宜选择对应亚细胞器内参更能体现内部参照的准确性。比如常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、TBP、YY1、Histone H3。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为ATP1A1。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

以上原则仅针对通常情况，需要特别注意的是内参的选择还须考虑实际实验环境状况，比如某些细胞或组织由于缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达量增高，此种状况下GAPDH不适合做内参；在涉及细胞增殖相关实验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；在凋亡实验中，TBP、Lamin B等不适合作为核内参。因此在设计实验方案时应考虑这些因素的影响并查询相关文献，如果在实验过程中出现内参表达出现异常状况应及时分析原因并调整内参选择。

10. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
解答：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，使用低浓度胶，如低至6％。提高转移电压／电流，增加转移时间。

1. 为什么实验结果无阳性或阳性弱？

1) 一抗和二抗不匹配，使用针对一抗的二抗（如一抗来自兔，二抗为抗兔抗体）。确保一抗和二抗的同种型匹配（例如，IgY和IgG）。

2) 没有足够的一抗与目标蛋白结合，提高一抗用量,建议4℃过夜孵育，延长孵育时间,增强抗原抗体结合，背景更低。

3) 由于不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效，由于储存和使用不当，导致抗体效价降低或失活，提高抗体浓度仍无阳性可做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。

4) 样本中没有目标蛋白，通过查阅资料确认样本中是否存在某蛋白表达，若无可参考资料建议做阳性对照。

5) 样本中目标蛋白含量太少，应用信号放大操作，例如，使用生物素偶联二抗和偶联酶的链霉亲和素（SABC试剂盒）。

6) 脱蜡不彻底，延长切片脱蜡时间，使用新配制的二甲苯。

7) 固定液封闭了抗体识别表位，固定时间过长会导致蛋白质空间结构发生折叠而遮盖抗原决定簇，可缩短样本固定时间，加强抗原修复。

8) 蛋白位于细胞核内（核蛋白），抗体不能穿透核膜，对样本进行破膜通透处理。

9) PBS缓冲液被细菌污染后破坏了靶蛋白的磷酸根，在抗体PBS储存液中加入适量防腐剂，或使用新鲜无菌的PBS。

2. 为什么我的片子背景很强而且非特异性着色很严重？

1) 未封闭或封闭不充分，延长封闭孵育时间，考虑更换封闭剂。推荐使用二抗种属来源的10%正常血清封闭1小时，或使用5% BSA封闭30分钟。另一种选择是用针对样品种属的Ig进行预吸附处理的二抗。

2) 一抗浓度过高，针对一抗做浓度梯度实验，选择合适浓度，缩短抗体和底物孵育时间。

3) 孵育温度过高，时间过长，选择4℃过夜或缩短孵育时间。

4) 二抗质量不佳，使用不加一抗的二抗对照。如果观察到二抗对照有染色，则更换二抗或使用针对样品种属Ig进行预吸附处理的二抗。

5) 内源性过氧化物酶含量过高，延长3%H₂O₂灭活时间或用0.5%高碘酸溶液室温孵育10min。

6) 固定过度，福尔马林/PFA通常会在绿光光谱内产生自发荧光，因此试着使用红光范围内的荧光素。

7) 注意实验操作细节，在所有步骤（除封闭）之间加强PBS充分洗涤，孵育时候切勿干片。

8) 通透作用破坏膜并除去了膜蛋白，使用较温和的去垢剂（例如，用Tween 20代替Triton X）。或去除缓冲液中的透化剂。

9) 一抗与被染组织同源(如用鼠一抗检测鼠组织)，二抗会与同源的所有组织结合，使用种属来源不同于样本种属的一抗，或检测系统使用生物素直标一抗和酶偶联的链霉亲和素。

3. 为什么我的标本着色部位不对？

1) 胞浆抗原出现胞核有着色。降低反应强度，减少修复时间；由于组织固定过久，及时更换标本。

2) 胞核抗原只出现胞浆表达。核抗原不易暴露，加强修复来充分暴露。

4. 免疫组化实验如何设置对照实验？

原则上讲，所有实验都应该设置阳性对照，阴性对照，空白对照。

阳性对照主要是确保实验流程没有问题，各试剂质量过关，多用已有明确蛋白表达的组织。

阴性对照是已知不表达检测蛋白的细胞系或组织切片，确认染色结果的特异性。

空白对照一般多用一抗来源的动物血清，用以排除非特异背景染色。

不过，由于样本选取的复杂性，国内多数实验室以及国外多数小实验室，都无法做到规范的阴性对照，所以普遍以空白对照代替阴性对照，而这种方法也在国内外得到承认。

5. 免疫组化检测时，如何控制显色背景？

在显色时，一定要在镜下严格观察结果变化，而不是一味的看显色时间，当阳性强而低背景时可以终止显色。在显色之前充分洗涤浸泡，若背景仍高的话可以用热的PBS洗涤。

6. 在实验中如何有效避免修复后切片出现脱片情况？

载玻片进行多聚赖氨酸防脱片处理。②在切片后及时烤片。③避免修复时间过长。⑤有些组织易于脱片，如骨组织、皮肤组织等，可以把切片浸泡在加热修复液中烫片修复。

7. 封闭液如何选择？

封闭液一般选择与二抗来源相同的种属，如二抗是羊抗兔，封闭液应选择羊血清。BSA一般也可以替代羊血清使用。

8. 你们的说明书上说一抗孵育可以是37℃2小时，也可以采用4℃过夜，那我到底应该采用哪种方法呢？

37℃2小时和4℃过夜的方法都可以得到较好的抗体孵育效果，但是37℃2小时孵育条件强，可能造成一些背景，所以如果安排方便的话，可以采用4℃过夜的方法，条件更加温和，而且结果的特异性更强，背景干净。

9. 显色后必须要进行苏木素复染吗？

苏木素主要是染细胞核，起一个定位的作用，更好判断阳性结果，这个不是必须要做的。

10. 抗体需要分装保存吗？

抗体比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃冰箱。分装可以最大程度降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了多次从同一管中吸取抗体造成污染的可能性。分装的量以一次实验用完为好，但建议最少不少于10μL每份。

1.信号弱

2.重复性差

3.数据降低

1. 如何选用细胞系培养基？

优先根据细胞来源公司提供的培养条件，其次参考ATCC推荐细胞对应培养基。一般建议不要随意更换培养基种类。细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供的培养条件不同的培养基，可能造成细胞形态发生变化或者无法存活以及细胞的表型或功能丢失。

2. 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

直接丢弃或者更换，将未受污染的细胞转移至其它培养箱，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台以及二氧化碳培养箱。如果发生真菌霉菌污染，需要将房间紫外照射以消除可能产生的孢子。发生污染后同时排除使用试剂的污染，包括培养基和血清，可以空培试验。

3. 为何培养基用一段时间后，颜色会偏紫？能否继续使用？

培养基随着多次开盖会使瓶内培养液CO2 逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性变紫，特别是剩的培养基越少越容易变紫。可以将培养瓶盖子拧松放入二氧化碳培养箱校正溶液PH值，过一段时间就会变回正常。变紫的培养基是可以继续使用的，培养细胞时会在培养箱自动恢复颜色。

4. 细胞培养液变黄，变浑，怎么处理？

细胞培养液变黄多半是细胞密度过大，细胞增殖速度过快，产生大量酸性代谢废物，细胞营养不足。应立即进行消化传代处理。而培养液变浑多半是发生了细菌污染。

5. 血清中出现的沉淀是什么?对细胞培养有影响吗？怎么去除？

1) 纤维蛋白，它是经常出现的较大的沉淀物，可以达到1-2mm，可以用肉眼观察到。

2) 胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质，它们也是血清中出现沉淀物的常见原因。

3) 磷酸钙，它也是常见的一种沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养的时候会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。

这些沉淀对细胞的生长是没有影响的，如果想去除尽量采用离心的方法弃掉沉淀，不建议用过滤的方法去除沉淀，因为会堵塞滤膜而且会有污染的风险。

6. 细胞何时换液最佳？

1) 细胞消化传代后建议隔天或者隔两天换一次液。

2) 细胞传代后发现碎片多、死细胞特别多在细胞形态已经出来的前提下可以第二天换液。

3) 对于生长速度较慢的细胞可以多放点培养基，减少换液次数，让细胞静养。

4) 细胞传代后细胞分布不均，细胞堆叠，细胞间隙大，局部密度大，这时不换液，可以采取消化重铺的方式。

7. 细胞支原体污染怎么处理？

支原体污染是比较难去除的，特别容易复发，一般建议直接更换新的细胞，如果特别精贵或者重要的细胞可以尝试使用四环素、大环内酯类抗生素（泰乐霉素）、喹诺酮类抗生素。

8. 如何控制胰酶消化时间？

胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤：消化过度细胞碎片增多，黑渣子增多，细胞会成片脱落，严重影响细胞活性，导致部分细胞漂浮；消化不足则细胞难于从瓶壁脱落，反复吹打同样也会损伤细胞活性。

不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。像贴壁不牢的293T和Lncap可能1-2分钟，Hela和A549可能2-3分钟，HEPG2和CACO-2可能5分钟，5637和A431可能10分钟左右。胰酶消化时间与胰酶的活性及浓度，是否含EDTA，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度有关。对于新购买的细胞，建议客户先用胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔30s镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

9. 如何避免血清沉淀物的产生?

1) 解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，

2) 解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

3) 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。

血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

10. 对细胞形态有疑问？

1) 确定细胞所使用的培养基种类是否为说明书建议的。改变了培养基种类细胞形态可能会有变化。

2) 以引种公司官网细胞照片为准，其次可以参考ATCC或DSMZ网站的图片。

3) 如果上皮型细胞很明显成为成纤维细胞或者成纤维细胞很明显成为上皮型细胞，那需要查看细胞是否提供了STR鉴定报告，身份是否正确。

4) 细胞的代次是否过高导致分化变异、细胞是否经过加药诱导、细胞是否经过转染等都会引起细胞形态出现变化。

5) 细胞低密度和高密度形态是不一样的，还有一些细胞呈现形态比较慢，细胞要1-2天才能伸展开。所以细胞的正常形态要等细胞密度起来后才能确定。

1. 为什么我的细胞凋亡会出现非特异性着色？

1) 标本原因，肝肾内源性生物素含量高，直接与SABC结合导致非特异性着色，皮肤肺组织胶原含量高，由于胶原带负电荷，易吸附试剂导致非特异性着色。

2) 固定时间过长会导致胞浆着色。

3) 洗涤不充分。

4) 显色剂氧化，显色时间长。

2. 为什么我的细胞凋亡实验没有阳性结果？

1) TDT酶保存一定要恰当，在常温下容易失活，应在-20℃保存。

2 )蛋白酶K消化时间不够，根据标本情况适当延长消化时间。

3) 实验中漏加试剂，实验操作不规范。

3. 为什么我的细胞凋亡的实验的阳性很弱？

1) 标记液量过低，解决方法：根据组织大小提高标记液用量。

2) 孵育时间过短，解决方法：延长孵育时间。

3) 液体流失，解决方法：补加试剂。

4) 显色时间过短，解决方法：在显微镜下控制反应时间。

5) 蛋白酶K消化时间不够, 解决方法：延长消化时间。

4. TUNEL法测凋亡细胞会出现假阳性或假阴性的情况吗？

会出现假阳性或假阴性的情况。在坏死晚期和高增殖的细胞中也可产生大量的DNA片段 ，这就有可能会出现假阳性；在某些形式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全，这就有可能出现假阴性。

5. TUNEL法检测组织里面的凋亡细胞，组织样本需要固定吗？

需要固定，并且需要及时固定。因为TUNEL法检测的是细胞中断裂的DNA片段，如果不及时固定DNA片段是会降解的。

    答：标本的消化对原位杂交比较重要，适当的消化使靶基因充分暴露，增强探针的接触性。但过度的消化将使标本明显减薄乃至消失，不同的标本对消化的敏感性不同。

    答：杂交后的洗涤跟信号及背景强度有密切关系。洗涤时间越短，信号越强，背景也越高；洗涤时间过长，信号越低，适当的洗涤时间会获得理想的信号强度和可以忽略的背景。

   答：固定液是不同的，做ISH的固定液里面需要加DEPC来防止mRNA的降解的，而做免疫组化的固定液里面可以不用加DEPC。

    答：有条件的可以灭菌和消毒，有些器皿也最好用DEPC处理，如果没有那个条件的也可以不处理，但要保持器皿干净。

1. 凋亡率低怎么办？

凋亡刺激不够，可以增加诱导凋亡试剂浓度和反应时间；做单染管对比检查荧光试剂效用；荧光易碎灭，反应完毕应尽快检测，最好在1h内。

2. 凋亡率高怎么办？

轻柔处理细胞，保证活细胞的状态良好；细胞收集后及时染色；降低Annexin V-FITC染色浓度。

3. 细胞过密产生假阳性的处理？

细胞密度不要超过1x106，避免细胞培养过程中自身引起的凋亡，而非外界处理因素。

4. 消化过度产生假阳性的处理？

消化过度可能造成PS外翻，得到假阳性结果。因此消化时最好用低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2-3次，尽量把胰酶造成损伤控制在5%以内。

5. 操作剧烈产生假阳性的处理？

处理贴壁细胞时要小心操作，力度过大可能造成细胞膜损伤，导致PS暴露，导致假阳性。

6. 液氮保存的组织块，能不能再做流式细胞分析？

不能，因为流式细胞分析要求细胞分散、单个，活性好，组织在冻存、复温的过程中会有大量的细胞死亡，同时经过这一过程的组织在分离成单个细胞的时候会形成许多细胞碎片，不宜上流式检测，所以用于流式检测的标本最好是新鲜标本，即取材后立即检测，效果最好。液氮保存的组织块，可以将组织标本进行切片，然后做原位染色，观察组织细胞的凋亡。

7. Annexin V能否用在植物和细菌中检测凋亡？

可以。

8. 血液样品可以做凋亡吗？

可以，但必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，干扰实验结果。

9. 如何统计凋亡细胞数？

Annexin V凋亡实验在做凋亡统计时一般统计细胞早期凋亡率，也有文献统计总的凋亡比例（早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞之和）。

10. 检测凋亡用的细胞能否固定？

甲醛固定液会造成结果假阳性，因此用于Annexin V凋亡检测的细胞不能进行固定。

11. 是否可以用PBS替代凋亡试剂盒里面的 Binding Buffer？

不行，Annexin V 与 PS 的结合依赖 Ca2+，Binding Buffer 含有 Ca2+，主要是促进Annexin V 与 PS 的结合。不加 Binding Buffer，会导致 Annexin V 的结合能力降低，造成阳性信号大幅下降甚至无阳性信号，Binding Buffer 是必须要加的。

1. 样品处理需要注意哪些？

未固定的样本应立即实验，根据实验目的选择最佳固定方法，避免因固定剂造成检测结果不稳定。新鲜组织标本应及时处理保存，以免在室温下放置时间过长，导致组织坏死及细胞自溶，从而影响检测结果。

2. 什么是空白对照？

空白对照就是不进行任何标记的细胞，主要目的是用于测定基础荧光信号表达值。设置空白对照管（未染色的细胞）来区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。

3. 什么是同型对照？

同型对照就是与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照。设置同型对照管，消除抗体非特异性结合到细胞上从而产生的背景荧光。

4. 如何确定样品是否需要破膜？

可通过蛋白信息数据库或其他文献查询蛋白在细胞/正常组织/癌变组织中的表达情况，以确定后续实验中该选取什么样品（细胞）来进行实验，以及是否使用破膜剂/破核膜剂来处理样品（细胞）。

5. 流式染色时间和温度如何选择？

流式染色是抗原抗体的结合反应，该过程结合非常快，而且非常牢固，但染色过程要尽量让所有抗原都能结合抗体分子，所以加入抗体时一定要混匀，我们一般选择室温染色15 min或者4℃染色30 min，染色中途混匀一次，建议轻弹管子（枪头吹打可能会对细胞受损，死细胞增多，导致非特异性结合增加）。

6. 如何减少补偿的干扰？

因为不同激光器激发的荧光染料之间几乎没有补偿的干扰，所以对于多激光器的仪器我们可通过选择不同激光器激发的染料来避免补偿的干扰，选择同一激光器激发的染料是，尽量选择染料之间发射光谱不重叠的染料。

7. FCM检测过程中如何调节补偿？

在FCM检测过程中，如果存在多色，则必须进行荧光补偿调节。调节补偿首先要知道双阴性细胞的情况，其次，必须要用单阳和双阴性细胞。只有在有阴性细胞作为参照的情况下，才能既不会过多又不会过少地调节补偿。

8. 细胞内染色选用什么样的荧光素？

对于胞内染色，应选用分子量较小的荧光素。

9. 补偿过高或增益过低导致无信号/荧光弱怎么办？

使用阳性对照再次设置补偿或在合理的范围内提高增益以增强信号。

10. 过量抗体被困导致荧光强度过高怎么办？

这是细胞内染色特有的问题，较大的荧光分子使抗体被困在细胞中。确保洗涤步骤充分，包括在洗涤缓冲液中加入吐温或Triton。