四色多重荧光染色试剂盒Plus（三标四色）

50T/3260 100T/5160

酪氨酸信号放大 (Tyramide dignal amplification，TSA) 技术，是一类利用辣根过氧化酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。TSA技术采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的TSA衍生荧光染料，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，将信号共价结合到抗原上。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

试剂盒组份	体积	稀释比	用途
3% H2O2	15ml/30ml	即用型	去除内源性过氧化物酶
EDTA抗原修复液（粉剂）	2包/3包	单包粉剂蒸馏水溶解定容至2L	用于免疫荧光实验中的抗原修复
5% BSA 封闭液	15ml/30ml	即用型	用于组织切片的封闭
HRP羊抗兔/鼠IgG	9ml/18ml	即用型	过氧化物酶标记羊抗兔/鼠IgG
TSA-520Plus荧光染料	25ul/50ul	1:200，浓缩型	荧光标记的酪氨酸盐经活化后与靶标周围的蛋白酪氨酸残基共价结合
TSA-570Plus荧光染料	25ul/50ul	1:200，浓缩型	荧光标记的酪氨酸盐经活化后与靶标周围的蛋白酪氨酸残基共价结合
TSA-690Plus荧光染料	25ul/50ul	1:200，浓缩型	荧光标记的酪氨酸盐经活化后与靶标周围的蛋白酪氨酸残基共价结合
TSA buffer	9ml/18ml	即用型	用于荧光染料稀释，维持反应体系稳定
DAPI染液	5ml/10ml	即用型	组织的细胞核染色
抗荧光淬灭封片剂	5ml/10ml	即用型	免疫荧光组织化学染色样品封片

1.石蜡切片，常规脱蜡至水。
2. 3% H2O2去离子水室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗，5min×3 次。
3.EDTA抗原修复液粉剂经蒸馏水溶解定容至2L可配制成柠檬酸盐修复工作液（PH6.0），将切片浸入到柠檬酸盐修复液中，微波炉加热到沸腾后断电，间隔5-10min再修复 1-2次，冷却至室温。
4.根据需要选择抗原修复方式及强度。可热修复、酶修复或不修复。
5.切片甩干后，免疫组化笔在组织周围画圈，滴加5%BSA封闭液37℃孵育30min，甩干，勿洗。
6.滴加适当稀释的一抗，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。PBS冲洗，5min×3次。
7.滴加HRP标记二抗，37℃孵育30min。PBS冲洗，5min×3次。
8.浓缩型荧光染料经TSA buffer进行稀释，稀释比例可依据具体情况灵活调整优化，一般稀释范围在1:50-500，圈内滴加相应的TSA荧光染料反应液，避光室温孵育1-15min。PBS冲洗，5min×3次。
9.将切片浸入到抗原修复液中 37℃水浴 25-40min。PBS 冲洗，5min×3 次。
10.重复步骤5-9步骤——第二轮标记。
11.重复步骤5-8步骤——第三轮标记。
12.滴加DAPI染色液，室温孵育5-10min。PBS冲洗，5min×3次。
13.切片甩干后，用抗荧光衰减封片剂封片。
14.荧光显微镜观察。

四色多重荧光染色试剂盒Plus（三标四色） (Boster Biological Technology, Wuhan, China. Catalog#PTSA-34)