使用说明
蛋白样品的制备
1. 样品的处理
取适当量的RIPA裂解液（见附表），放与4℃预冷，使用前数分钟内加入PMSF（见附表）和磷酸酶抑制剂（见附表）。
组织样本处理：
手术切除的组织块迅速置于预冷的PBS（见附表）中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组织表面液体，将组织切成几个较小的组织块。称量组织，按组织净重(g)：裂解液(ml)=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，匀浆器匀浆，肉眼观察无明显组织块，冰上孵育30分钟。10000g离心10分钟，取上清，即为蛋白提取物。
细胞样本处理：
贴壁细胞，细胞刮刮下细胞，计数，并收集5×106 个细胞，600g 离心5分钟，尽量吸尽上清，用预冷的PBS（见附表）重悬细胞，600g 离心5分钟收集细胞，尽量吸尽上清，加入0.5ml的预冷的裂解液，用移液器吹打数下，冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟，取上清，即为蛋白提取物。
悬浮细胞，计数，并收集5×106 个细胞，600g 离心5分钟，尽量吸尽上清，用预冷的PBS（见附表）重悬细胞，600g 离心5分钟收集细胞，尽量吸尽上清，加入0.5ml的预冷的裂解液，用移液器吹打数下，冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟，取上清，即为蛋白提取物。
注：裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA的复合物，可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验，超声条件：在100-120W的功率下，超声处理样本1min，冰浴条件下进行，超声2s，间隔2s。
2. BCA法测定蛋白浓度（参见附录中BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明）。
3. 用PBS调整蛋白浓度，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液（使用说明参见附录）。
注：待测样本建议总蛋白上样量为50μg，尽量保持单个待测样本上样体积为10μl。
电泳
1. 根据靶蛋白的分子量大小配制不同浓度的凝胶（凝胶配制见附录）。每个泳道加入待测样本和蛋白Marker（见附录），加入电泳缓缓冲液（见附录），开始电泳。
2. 80V恒压电泳，待溴酚蓝跑到凝胶分界处，改为恒压120V，跑完全程，电泳结束。
转膜
1. 根据靶蛋白的分子量选择不同孔径的PVDF膜（见附表），将PVDF膜置于甲醇中15s使其活化，将PVDF膜浸入水中1-2min以置换甲醇，将PVDF膜浸泡在转膜缓冲液（见附录）中5min以置换水，同时将滤纸和纤维垫浸泡在转膜缓冲液中待用。
2. 按照黑色板（负极）-纤维垫-滤纸-凝胶-膜-滤纸-纤维垫-白色板（正极）依次放好，排出气泡，夹紧后放入湿转电转槽内，根据靶蛋白分子量调整转膜条件。转膜过程在低温下进行。
注：此为湿转的参考步骤，如用其他转膜方法，请依据具体情况进行调整。
3. 转膜完成后，小心取出PVDF膜，TBS-T溶液（见附表）洗涤3次，每次10min。
免疫印迹
1. 用含5%脱脂奶粉（见附表）的TBS-T溶液浸泡PVDF膜，室温封闭1.5h，摇床摇晃。
2. 用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜，摇床摇晃。
3. TBS-T溶液洗涤PVDF膜3次，每次10min。
4. 用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的二抗，室温孵育1.5h，摇床摇晃。
5. TBS-T溶液洗涤PVDF膜3次，每次10min。
显色曝光
1. 将ECL发光检测液中的A液和B液按1:1比例混匀。
2. PVDF膜从TBS-T溶液洗液中取出后用滤纸吸干，均匀滴加ECL混合液与PVDF膜上，排出气泡，即可曝光。
3. 调节仪器，多次曝光获取最佳图片效果。
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