BCA蛋白浓度测定试剂盒

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碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，吸光度强度与蛋白浓度成正比。测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
1.准确灵敏，线性范围广，BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000ug/ml。
2.快速：45分钟内完成测定。
3.经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。
4.不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。
5.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

A液 100ml
B液 5ml
蛋白标准品 20ml（2mg/ml）

室温保存，一年有效。

使用方法：
一. 配制BSA标准品 注：标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。 BSA标准品配制可参照下表（微孔板检测，线性范围20-2000μg/ml）
管号 稀释液体积(μl) 2mg/ml BSA体积(μl) BSA终浓度(μg/ml)
A 0 100 2000
B 25 75 1500
C 50 50 1000
D 125 75 750
E 150 50 500
F 350 50 250
G 375 25 125
H 395 5 25
I 400 0 0=Blank（空白孔）
如用试管法检测，每管需加100μl标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300μl。
二.配制BCA工作液
A.计算所需要的总BCA工作液体积。总BCA工作液体积=（标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的BCA工作液
注意：试管法检测时每个样品加2.0ml BCA工作液，微孔板检测每个样品加200μl BCA工作液。
B.配制BCA工作液：50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。
注意：BCA试剂B加入BCA试剂A中后，迅速浑浊，通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内，室温条件24h稳定。
三.试管法（样品：BCA工作液=1:20）
1.各取100μl标准品和待测样品加入到反应管中。
2.每管加入2.0ml BCA工作液，混匀，37℃孵育30min。
注意：也可室温孵育2h，或者60℃孵育30min。BCA检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应，升高温度会加快显色反应，但是温度升高和时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。
3.冷却到室温。在分光光度计上进行检测，设定波长为562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。然后在10分钟内对所有样品读数。
注意：由于BCA反应达不到真正的反应终点，即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是，由于室温下生色比率相当低，因此若是10min内能对所有的样本进行562nm吸光度的测试，不会导致明显错误。
4.根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X=蛋白浓度ug/ml；Y=最终的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
四.微孔板法（样品：BCA工作液=1:8）
1.各取25μl标准品和待测样品加入到微孔板中。
注意：样品与工作液比例为1:8，若样品有限，可使用10μl标准品和待检测样品进行检测（即1:20），这时试剂盒的检测范围为125-2000μg/ml。
2.每孔加入200μl BCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。
3.冷却到室温，在酶标仪上的540～595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为最佳。
注意：延长孵育时间或者提高（样品：BCA工作液比）会增高每个孔的OD562nm净值，并且降低检测下限和工作线性范围。
4.根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X=蛋白浓度ug/ml；Y=最终的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。

注意事项：
1.低温或长期保存，若发现BCA试剂A或者试剂B有沉淀发生，请37ºC温育并伴随搅拌促使其充分溶解。如发现细菌污染，则应丢弃，避免对实验结果造成影响。
2.不受大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80等。（详情见附录）
3.每次测量蛋白浓度均应做标准曲线。
4.当试剂A和B混合时会有浑浊，混匀后就会消失。
5.需准备37℃水浴或温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为540-595nm之间，562nm最佳。酶标仪需与96孔酶标板配套使用。使用分光光度计测定蛋白浓度时，试剂盒测定的样品数量会因此而减少。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。
6.使用BCA蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，因此需注意保持定时和定温，以确保精确定量。 7.实验操作规范，提高上样量的精确度。