ECM Kit(大鼠IgG)

Kit/420

4℃保存，一年有效。

1．蛋白质的样品制备： 1) 细胞培养蛋白质样品的制备： 1：胰酶消化后裂解：细胞培养至80%左右密度时，以含0.25%胰蛋白酶消化,室温，低速离心，弃上清。细胞经预冷的PBS 漂洗3 次，加入0.1-1ml 裂解液(根据细胞数量定)反复吹打。 2：皿上直接裂解： 细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS 漂洗3 次，加入0.1-1ml 裂解液(根据细胞数量定)，用细胞刮刀收集，转移至离心管中，反复吹打。 2）组织样品的制备： 新鲜组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，按组织净重：裂解液=1：10 的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理） 3）蛋白变性：处理后的样品加入样品缓冲液（按样品浓度1：1 或1：2 的比例）混匀，样品置1000C 的水浴箱加热3-5 分钟，10000g 离心10 分钟，取上清液。（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃可稳定保持数月。） 2．SDS-PAGE电泳： 1）．制胶: ①按比例配制分离胶（丙烯酰胺母液：单体：双体=29：1），缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，37℃恒温箱中静置60min。 ②同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多的氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，37℃恒温箱中静置60min 以上以保证完全聚合。 2）加样：依次加入标准品和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。样品一般在1.0mm 厚的胶加样50-100ug/lane)。 3）电泳： 加样完毕，选择适当的电压进行电泳即可。一般采用恒压浓缩胶55V，分离胶75V，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。 3．转膜： 蛋白质经SDS-PAGE 分离后，从凝胶中转移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纤维膜即NC 膜（AR0135）或PVDF 膜。Tris/甘氨酸-SDS-PAGE 结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，包括湿式电转印和干式电转印。 1）干式电转印： 将转印槽阴极平放工作台上，并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸，将电转印液浸透0.45μm 的N.C 膜放在滤纸上，再将凝胶平放在N.C 膜上，最后在凝胶上加盖三层电转印液浸透1mm 厚的滤纸，电流根据凝胶面积按1-2 mA/cm2, 接通电源，经1-1.5 小时电转印。 2）湿式电转印： 打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放三块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC 膜、凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC 膜平放在凝胶上，按照(-) 夹板-海棉-滤纸-胶块-NC 膜-滤纸-海绵-夹板(+)装好, 3）依次除尽每层间气泡，夹好电转印夹。电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内，连接好电极，接通电流，转印夹的NC 膜应对电泳槽的正极, 4℃ 250-300mA, 转印80min（根据分子量不同，转印时间可适当调整）。 4、膜的封闭: 漂洗转印膜,室温，3 次x10min, 以尽量洗去转印膜上的SDS (以免影响抗体的结合)，放入0.02M TBS 缓冲液配置的5%脱脂奶粉和1%的BSA 混合的封闭液内，摇床摇动，室温封闭2h 或4℃过夜。1xTBS-T ，PH7.6 洗液，室温漂洗10min。 5、抗体杂交： 1) 封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入用0.02M TBS 缓冲液配置的2%脱脂奶粉和1%的BSA 混合的稀释液适当稀释的一抗，4℃孵育过夜或37℃孵育2h，1xTBS-T ，PH7.6 洗液洗膜3 次x10min。（一抗的稀释度，孵育时间，温度与显色强度，背景有直接关系。一般来说，阳性不强时可提高一抗浓度和延长孵育时间，而背景高，非特异性条带多，则降低抗体浓度和孵育时间）。 2）用0.02M TBS 缓冲液配置的2%脱脂奶粉和1%的BSA 混合的稀释液适当稀释过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG 孵育膜，20℃-37℃ 1.5 小时或 4℃过夜， 1xTBS-T 洗膜3 X 10min。 6、显色（ECM）： ECM 显色剂配制:按1ml 蒸馏水，加显色剂A、B 各1 滴混匀。将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上混合好的显色液反应约1-5 分钟。吸去印迹膜边缘显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,以确保X 感光胶片的干燥。印迹膜转入暗室中使胶片曝光30＇-5 分钟。 7、显影，定影： 将曝光后的X 感光胶片(博士德有售,货号AR0134)放入显影液(博士德有售,货号AR0132)中冲洗至胶片上出现条带或者胶片透明为止,再放入定影液(博士德有售,货号AR0133)中定影，胶片可长期保存。 附录： 1:对照的设置内参照: 提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白; 阳性对照: 即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量;阴性对照: 即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞。

ECM Kit(大鼠IgG) (Boster Biological Technology, Wuhan, China. Catalog#EK1004)