通用型原位杂交检测试剂盒Ⅲ(AP)

Kit/1280

组分名称	规格	用途/用法	保存条件
胃蛋白酶(×10)	1ml	用蛋白酶稀释液按照1:10比例稀释	4℃可保存一年，应避免冷冻。
蛋白酶稀释液	12ml	为3%柠檬酸。用于稀释胃蛋白酶
预杂交液	2ml	探针杂交前的预杂交。即用型，直接滴加
探针稀释液	2ml	用于稀释探针
封闭液	5ml	抗体孵育前的封闭。即用型，直接滴加
鼠抗地高辛抗体 （AP, 200X）	0.25ml	碱性磷酸酶标记的小鼠抗地高辛抗体。浓缩液，需用0.01M TBS稀释200倍
显色剂A(×20)	0.5ml	BCIP/NBT 显色剂A，需稀释20倍
显色剂B(×20)	0.5ml	BCIP/NBT 显色剂B，需稀释20倍
中性核固红	6ml	复染，即用型，直接滴加
水溶性封片剂	6ml	封片剂，即用型，直接滴加封片

原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油； 缓冲液（3%柠檬酸，2×SSC(AR0058)，0.5×SSC，0.2×SSC，0.5M PBS(AR0033), 0.01M TBS(AR0031））

操作程序
一．细胞和冰冻切片 准备工作：缓冲液的配备 3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O7·H2O）3g,pH2.0左右。 2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。 0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。 0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。 20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。 0.5M PBS——1000ml蒸馏水加氯化钠30g，Na2HPO4·12H2O 6g，NaH2PO4·2H2O 0.4g，pH7.2-7.6。 0.01M TBS, pH7.2--7.6。(配法:1L 双蒸馏水中加入 8.5 克氯化钠,1.2 克 Tris )。 操作程序： 注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外，过度固定对原位杂交有明显的不利影响。 1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。 2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.5M PBS(pH7.4)洗2分钟×3次。 3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛，含有1/1000 DEPC。室温固定20–30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。 4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。 5．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱37-40℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。 6．杂交：用杂交稀释液 稀释地高辛标记的寡核苷酸探针，浓度一般0.5-2μg/ml。按每张切片加20μι杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后，盖在切片上。恒温箱37—40℃杂交过夜。 7．杂交后洗涤：去掉盖玻片，30—37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；0.5×SSC洗涤15分钟×1次；0.2×SSC洗涤15分钟×1次。必要时可重复0.2×SSC洗涤1次。 8．滴加封闭液：37℃20分钟。甩去多余液体，不洗。 9．滴加碱性磷酸酶标记小鼠抗地高辛：用0.01M TBS 按1：200稀释，37℃60分钟。 或室温2小时。0.01M TBS洗5-10分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。 10．BCIP/NBT显色：BCIP/NBT （×20）按1：20的比例用0.01M TBS(pH9.2)稀释，混匀。显色液加至标本上。一般30—37℃显色30-60分钟。也可以在室温或4℃显色1-24小时。若无背景出现则可继续显色，直至结果满意为止。充分水洗。 11．必要时核固红复染5-15分钟，水洗。 12．水溶性封片剂封片。二．石蜡切片 如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一定不要超过1小时。 1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。 2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。 3．石蜡切片经常规脱蜡至水。 4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3–30分钟（视标本厚薄、新旧自行调整）。用户可以比较不同的消化时间，例如10分钟，20分钟，30分钟，以找到最佳的消化时间。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。 其余步骤和冰冻切片5-12步相同。 结果观察：mRNA的细胞胞浆着色呈紫蓝色。 如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。有其它明显的非特异性染色现象时，可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—5倍。

4°C保存一年

1、注意低温保存，避免污染；2、使用时穿戴好实验服和一次性手套

通用型原位杂交检测试剂盒Ⅲ(AP) (Boster Biological Technology, Wuhan, China. Catalog#MK1031)