敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅳ(CY3)

Kit/1280

编号	名称	规格
1	胃蛋白酶（×10；Pepsin）	2ml
2	预杂交液	2ml
3	寡核苷酸探针杂交稀释液	2ml
4	封闭液	5ml
5	生物素化鼠抗地高辛	5ml
6	SABC-CY3	100μl(1:100)

该试剂盒适用于探针是地高辛标记的mRNA杂交

原位杂交专用盖玻片；
POLY-L-LYSINE；
DEPC；
20%甘油；
缓冲液（3%柠檬酸，2×SSC(AR0058)，0.5×SSC，0.2×SSC，0.5M PBS(AR0033)）

操作流程
一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：
3%柠檬酸——100ml 蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O7·H2O）3g，pH2.0 左右。
2×SSC——1000ml 蒸馏水中加氯化钠 17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na3·2H2O，分子量 294）8.8g。
0.5×SSC——300ml 蒸馏水加 100ml 2×SSC 即可。
0.2×SSC——270ml 蒸馏水加 30ml 2×SSC 即可。
20%甘油——20ml 甘油加 80ml 蒸馏水即可。
0.5M PBS——1000ml 蒸馏水加氯化钠 30g，Na2HPO4·12H2O 6g，NaH2PO4·2H2O 0.4g， PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入 0.1%的 DEPC 处理，以抑制 RNA 酶对 mRNA 的分解作用。
1. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或 APES。切片厚度 10-20μm。
2. 细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为 37℃和 5%的 CO2，所用培养基为 Dulbecco 基础培养基。细胞长好后 0.5M PBS(PH7.4)洗 2min×3 次。
3. 培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为 4%多聚甲醛，含有 1/1000 DEPC。 室温固定 20-30min。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存 2 周以上。
4. 暴露 mRNA 片段：切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3%柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化 5-120 秒钟。有时也可以不消化。0.5M PBS 洗 3 次× 5min。蒸馏水洗 1 次。
5. 预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度。按每张切片 20μl 加预杂交液。恒温箱 37-40℃ 2-4 小时。吸取多余液体，不洗。
6. 杂交——用杂交稀释液稀释地高辛标记的寡核苷酸探针，浓度一般 0.5-2μg/ml。按每张切 片加 20μl 杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后，盖在切片上。恒温箱 37-40℃杂 交过夜。
7. 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，30-37℃左右水温的 2×SSC 洗涤 5min×2 次；0.5×SSC 洗涤 15 min×1 次；0.2×SSC 洗涤 15min×1 次。必要时可重复 0.2×SSC 洗涤 1 次。
8. 滴加封闭液：37℃ 30min。甩去多余液体，不洗。
9. 滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60min 或室温 120min。0.5M PBS 洗 5min×4 次。勿用其它 缓冲液和蒸馏水洗涤。
10. 滴加 SABC-CY3：取 1μl SABC–CY3 加原位杂交用 PBS 100μl，每张切片加 50μl 37℃ 30min。0.5M PBS 洗 5min×3 次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
11. 用水溶性封片剂或抗荧光衰减封片剂封片后，荧光显微镜观察。
二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为 4% 多聚甲醛，含有 1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过 4mm 的小块，固定 1 小时即可， 较大的标本固定不要超过 2 小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间 30-40min， 一般不要超过 1 小时。
1. 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度 6-8μm。
2. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或 APES。
3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。
4. 暴露 mRNA 片段：切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3%柠檬酸加 2 滴浓 缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化 3-30min（视标本新旧、厚薄自行调整）。充分的 消化可以使 mRNA 得到暴露，从而增强杂交信号；但另一方面，过度的消化又使切片明显 减薄乃至消失，从而失去杂交信号。由于用户的切片情况各不相同，这就需要用户比较不 同的消化时间，例如 5min，10min，20min，30min。以找到最佳的消化时间。0.5M PBS 洗 3 次×5min。蒸馏水洗 1 次。
其余步骤和冰冻切片 5-11 步相同。
结果观察：阳性细胞的胞浆着色呈红色。
注意事项：如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往 和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。有其它明显的非特异性染色现象时，可以用预 杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释 2-5 倍。

4°C保存一年

1、注意低温保存，避免污染；
2、使用时穿戴好实验服和一次性手套;

敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅳ(CY3) (Boster Biological Technology, Wuhan, China. Catalog#MK1033)