正式实验前务必选取2-3个预期差异较大的样本做测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
①组织样本:称取约0.1g组织(水分充足的样本可取0.5g),加入1mL 提取液,进行冰浴匀浆,在4℃ 12000g离心10min,取上清,置冰上待测。
【注】若增加样本量,可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
②细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10
4个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
③液体样本:直接检测,若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测
①酶标仪预热30min以上,同时水浴锅加热到90-95℃。
②在EP管中依次加入:
| 试剂名称(μL) | 样本管 | 标准品管 |
| 工作液 | 300 | 300 |
| 样本 | 200 | |
| 标准品 | | 200 |
| 混匀后,在 90-95℃水浴中保温 30min(管口用封口膜封紧或者用重物压实),取出放冰上冷却,25℃,8000g 离心 5min,取 200μL 上清液至 96 孔板中,分别于 532nm 和 600nm 处读取吸光度A,ΔA=A532-A600。 |
【注】: 若是样本量极少的血清,可减少加样体积V1(如由200减至25,并用生理盐水
或蒸馏水补齐至200),则改变后的加样量V1需重新带入公式计算。