正式实验前务必选取2-3个预期差异较大的样本做测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
①组织样本:
称取约0.1g组织(水分充足的样本可取0.5g),加入1mL提取液,进行冰浴匀浆,在4℃、12000g条件下离心10min,取上清,置冰上待测。
【注】若增加样本量,可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
②细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10
4个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例进行提取(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液)。超声波破碎细菌或细胞,超声条件为:冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次;随后在4℃、12000g条件下离心10min,取上清,置冰上待测。
③液体样本:
直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测
① 酶标仪预热30min以上,同时将水浴锅加热至90~95℃。
②在EP管中依次加入:
| 试剂名称(μL) |
样本管 |
标准品管 |
| 工作液 |
300 |
300 |
| 样本 |
200 |
|
| 标准品 |
|
200 |
混匀后,在90~95℃水浴中保温30min,管口用封口膜封紧或用重物压实。取出后置于冰上冷却,在25℃、8000g条件下离心10min,取200μL上清液加入96孔板中,分别于532nm和600nm处读取吸光度A。
ΔA=A532-A600
【注】若样本量极少,如血清样本,可减少加样体积V
1(例如由200μL减少至25μL),并用生理盐水或蒸馏水补足至200μL。改变后的加样体积V
1需重新代入公式进行计算。