正式实验前务必选取2-3个预期差异较大的样本做测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
①组织样本:
称取约0.1g组织(水分充足的样本可取0.5g),加入1mL提取液,进行冰浴匀浆,在4℃、12000g条件下离心10min,取上清,置冰上待测。
【注】若增加样本量,可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
②细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10
4个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例进行提取(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液)。超声波破碎细菌或细胞,超声条件为:冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次;随后在4℃、12000g条件下离心10min,取上清,置冰上待测。
③液体样本:
直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测
①酶标仪预热30min以上,调节波长至540nm。
②在96孔板中依次加入:
| 试剂名称(μL) |
样本管 |
空白管 |
标准品管 |
| 样本 |
50 |
|
|
| 蒸馏水 |
|
50 |
|
| 标准品 |
|
|
50 |
| 试剂一 |
50 |
50 |
50 |
| 试剂二 |
50 |
50 |
50 |
混匀,室温孵育5min,在540nm处测定吸光值A。
ΔA=A样本管-A空白管
【注】可以将试剂一与试剂二等体积混合后加入,每孔加入100μL混合液。