正式实验前务必选取2-3个预期差异较大的样本做测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
①组织样本:
称取约0.1g组织(水分充足的样本可取0.5g),加入1mL提取液,进行冰浴匀浆,在4℃、12000g条件下离心10min,上清备用。将上清液与试剂一按照9:1的比例混合(如0.45mL上清液加入0.05mL试剂一),室温放置10min后,在室温、8000g条件下离心10min,取上清待测。
【注】若增加样本量,可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
②细菌/细胞样本:
先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10
4个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例进行提取(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液)。超声波破碎细菌或细胞,超声条件为:冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次;随后在4℃、12000g条件下离心10min,上清备用。将上清液与试剂一按照9:1的比例混合(如0.45mL上清液加入0.05mL试剂一),室温放置10min后,在室温、12000g条件下离心10min,取上清待测。
③液体样本:
直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测
①酶标仪预热30min以上,调节波长至370nm。
②在EP管中依次加入:
| 试剂名称(μL) |
测定管 |
空白管(仅做一次) |
| 样本 |
80 |
|
| 蒸馏水 |
|
80 |
| 试剂二 |
160 |
160 |
混匀,37℃避光反应30min。
| 试剂名称(μL) |
测定管 |
空白管(仅做一次) |
| 试剂三 |
200 |
200 |
混匀,在4℃、8000g条件下离心10min,弃上清,保留沉淀。
| 试剂名称(μL) |
测定管 |
空白管(仅做一次) |
| 试剂四(自备) |
400 |
400 |
涡旋混匀,在4℃、8000g条件下离心10min,弃上清,保留沉淀。
此步骤(加入试剂四)需重复操作2次。
| 试剂名称(μL) |
测定管 |
空白管(仅做一次) |
| 试剂五 |
400 |
400 |
涡旋混匀,37℃孵育15min,尽量使沉淀充分溶解;随后在4℃、8000g条件下离心10min,取200μL上清液加入96孔板中,于370nm处测定吸光值。
ΔA=A测定管-A空白管