正式实验前务必选取2-3个预期差异较大的样本做测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
①组织样本:称取约0.1g组织,加入1mL 提取液,进行冰浴匀浆,在4℃ 12000g离心10min,取上清待测。
【注】若增加样本量,可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
②细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10
4个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000g 4℃离心10min,取上清待测。
③液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测
①酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm。
②加入试剂一时,请务必全部加入到样本液体中;若批量测定则试剂二、三、四、五可按照10:10:130:10配成混合液,按照160μL加样量操作。
③在96孔板中依次加入:
| 试剂名称(μL) | 测定管 |
| 样本 | 20 |
| 试剂一 | 20 |
| 混匀,室温(25℃)孵育10min。 |
| 试剂二 | 10 |
| 试剂三 | 10 |
| 试剂四 | 130 |
| 试剂五 | 10 |
| 混匀,室温(25℃)下,立即在412nm处测吸光值A1,10min后测吸光值A2,ΔA=A2-A1 |