正式实验前务必选取2-3个预期差异较大的样本做测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
①组织样本:称取约0.1g组织(水分充足样本可取0.5g),加入1mL 提取液,进行冰浴匀浆,在4℃ 12000g离心10min,取上清,置冰上待测。
【注】若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10的比例进行提取。
②果实样本(水分含量高的果实):称取约1g果实组织样本,加入经预冷的5mL纯乙醇,冰浴匀浆(保证乙醇在整个匀浆液中体积80%以上),低温(可放冰上或4℃冰箱)放置10min;4℃ 12000g离心10min;弃上清,留沉淀。再向沉淀中加入经预冷的5mL纯乙醇混匀,4℃放置10min;4℃ 12000g离心10min;弃上清,留沉淀。最后向沉淀中加入1mL经预冷的提取液,涡旋混匀,4℃ 12000g离心10min,取上清液置于冰上待测。
③液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、上机检测
①酶标仪预热30min以上,调节波长至420nm。
②所有试剂解冻至室温(25℃)或于水浴锅(25℃)中孵育15-30min。
③在96孔板中依次加入:
| 试剂名称(μL) | 测定管 |
| 样本 | 50 |
| 试剂一 | 140 |
| 试剂二 | 10 |
| 混匀,立即于420nm处读取各管吸光值A1,5分钟后读取A2,ΔA=A2-A1。 |