正式实验前务必选取2-3个预期差异较大的样本做测定,了解本批样本情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备:
①组织样本:称取约0.1g组织(水分充足样本可取0.5g),加入1mL 提取液,进行冰浴匀浆,转移至EP管后,在90℃水浴中振荡提取10min;冷却至室温后,在25℃ 12000g离心10min,取上清待测。
【注】若增加样本量,可以按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
②细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(10
4个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);在90℃水浴振荡提取10min;冷却至室温后,在25℃ 12000g离心10min,取上清待测。
③液体样本:取0.1mL液体样本加入1mL提取液,进行冰浴匀浆,转移至EP管后,在90℃水浴振荡提取10min,冷却至室温后,在25℃ 12000g离心10min,取上清待测。
【注】若增加样本量,可以按液体体积(mL):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
2、上机检测
①酶标仪预热30min以上,调节波长至520nm。
②在EP管中依次加入:
| 试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管(仅做一次) |
| 样本 | 150 | |
| 蒸馏水 | | 150 |
| 冰醋酸 | 150 | 150 |
| 试剂一 | 300 | 300 |
| 混匀,置于95℃水浴中加热30min(盖紧封口,防止盖子爆开水分散失),冷却至室温。吸取200μL澄清液体于96孔板中,立即于520nm处测吸光值,ΔA=A测定管-A空白管 |