细胞培养(Cell Culture)

发布时间：2023-08-22

细胞培养做为生物学研究最基础的技术之一，可以说是渗透科研界的方方面面。常有新手小白在实验哀嚎，养好这些“娇贵”的细胞怎么这么难：要么贴壁不牢，要么突然被污染，要么细胞又死了……培养细胞细节繁琐，失败率较高，每步操作都马虎不得。下面博士德将为大家介绍和演示细胞复苏、传代、冻存等一系列具体操作步骤和实验要点，希望各位同学都能和细胞愉快的玩耍。

细胞培养实验操作视频

细胞复苏步骤：

取出冻存管→37℃水浴快速解冻→1000rpm离心→重悬细胞沉淀→补充完全培养基→二氧化碳培养箱培养
细胞冻存步骤：

细胞到达90%密度→制备单细胞悬液→1000rpm离心→加入冻存液重悬细胞→梯度降温→转移到液氮罐保存

细胞传代步骤：

移除原液→PBS清洗→胰酶消化→完培终止→吹散细胞→离心去胰酶→分瓶补充完培

细胞培养实验产品清单

细胞培养实验操作步骤

一、细胞复苏

1. 将10ml移液管、移液枪、1ml枪头、50ml离心管、T25培养瓶、酒精灯、废液缸等物品放入超净工作台，紫外灯照射30min后再通风30min；

2. 预热培养基；

3. 用75%酒精消毒后放入超净工作台；

4. 将冻存细胞从液氮罐中取出；

5. 放入一次性手套于37℃水浴锅中快速晃动使其融化；

6. 用75%酒精消毒后放入超净工作台；

7. 吸取9ml培养基到50ml离心管中；

8. 用1ml枪头吸取解冻的细胞悬液于离心管中；

9. 1000r/min,离心5min；

10.用75%酒精消毒后放入超净工作台；

11.吸弃上清液；

12.吸取1ml培养基重悬细胞，将细胞悬液转移到培养瓶内，补加适量培养基，轻轻晃动培养瓶使细胞分布均匀，并做好标记；

13.在显微镜下观察复苏的细胞密度及状态；

14.将细胞放回二氧化碳培养箱中静置培养。

注意事项：

1. 从液氮罐中取出细胞时，应做好个人防护以免冻伤；

2. 冻存细胞取出后，如不能立即放入水浴锅中融化，需将其放在干冰上保存转移；

3. 细胞水浴解冻时间以1min内为宜，做到慢冻速融；

4. 已解冻的细胞避免长时间常温存放，需尽快离心去除DMSO；

5. 刚复苏的细胞贴壁尚不牢固，24h内不要频繁观察和换液；

6. 将培养瓶放入培养箱，并将瓶盖旋松，以便进行充分的气体交换（如使用透气性瓶盖，则无需旋松瓶盖）。

二、细胞传代

贴壁细胞传代（以T25瓶为例）

1. 显微镜下观察细胞汇合度大于80%即可传代；

2. 将移液管、移液枪、T25培养瓶、1ml枪头、PBS溶液等放入超净工作台，紫外灯灭菌30min后再通风30min；

3. 培养基放置37℃水浴锅预热；

4. 将胰酶和培养基用75%酒精消毒后放入超净工作台；

5. 在培养箱内旋紧培养瓶瓶盖，拿出细胞，用75%酒精消毒后放入超净工作台；

6. 吸弃上清液；

7. 用5mlPBS液润洗细胞，吸弃PBS；

8. 培养瓶加入1ml胰酶，轻轻晃动使胰酶充分覆盖细胞层，放入培养箱中孵育；

9. 在显微镜下观察细胞解离状况，细胞明显变圆、细胞间隙增大，轻轻晃动可呈现流沙状即可终止；

10.加入4ml培养基终止消化，吹打细胞层表面数次，使其分散成单个细胞；

11.收集细胞悬液到50ml离心管中，1000-1200r/min离心，3-5min去除胰酶；

12.离心管用75%酒精消毒后放入超净工作台，吸弃上清液，用新鲜培养基重悬细胞；

13.将细胞悬液按推荐传代比例分装到培养瓶，补充适量培养基，摇晃使细胞分布均匀，并做好标记；

14.在显微镜下观察细胞密度及状态，把细胞放回培养箱，旋松瓶盖以便进行气体交换。

注意事项：

1.PBS润洗细胞时，从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入PBS，避免冲刷到细胞层；

2.不同细胞的胰酶所需消化时间不一样，消化时间根据细胞贴壁特性而定，可每30s观察一次。

悬浮细胞传代（以T25瓶为例）

1. 在显微镜下观察细胞的状态及密度是否可传代；

2. 将移液管、移液枪、T25培养瓶、1ml枪头、PBS溶液等放入超净工作台，紫外灯灭菌30min后再通风30min。

方法一：

1. 从培养箱中取出培养瓶，轻轻晃动使细胞分布均匀；

2. 吸取200ul细胞悬液计数，根据计数结果进行适当比例传代；

3. 将细胞分装到培养瓶中，加入适量的新鲜培养基，并做好标记；

4. 将培养瓶放入培养箱中，瓶盖旋松以便进行充分的气体交换。

方法二:

1. 将细胞悬液转移至离心管中，以800r/min离心3-5min；

2. 吸弃上清液；

3. 用1ml预热培养基重悬细胞沉淀，根据沉淀量将细胞稀释，然后分装到培养瓶中，将10ml的培养基加入培养瓶中，并做好标记；

4. 将培养瓶放入培养箱中，瓶盖旋松以便进行充分的气体交换。

注意事项：

悬浮细胞需要用未经TC处理的细胞瓶或培养皿培养，如悬浮细胞无碎片，建议按方法一传代。

三、细胞冻存 

1. 用50ml离心管收集细胞悬液，1000-1200r/min离心3-5min；

2. 吸弃上清液；

3. 用预冷的(2-8℃)低温冻存液重悬细胞沉淀（建议冻存细胞密度为1×106~1×107 个/ml）；

4. 将细胞悬液分装到若干冻存管中，并标记细胞名称、冻存时间及操作者。分装时应注意轻轻混合细胞，使其保持均匀的细胞悬液状态；

5. 将冻存管转至程序降温盒并放入-80℃冰箱冻存，4h后或过夜转至液氮（若使用无血清冻存液则直接放入-80℃冰箱，24h后转到液氮长期保存）。

注意事项：

1. 选取对数生长期的细胞进行冻存，此时细胞状态比较好；

2. 冻存的细胞不易长期在-80℃环境中存储，应尽快转入液氮罐中；

3. 细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮中长期保存，为稳妥起见，可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况再继续冻存；

4. 不同冻存液的冻存方式不一样，详见说明书。

细胞培养实验常见问题

1.如何选用细胞系培养基？

优先根据细胞来源公司提供的培养条件，其次参考ATCC推荐细胞对应培养基。一般建议不要随意更换培养基种类。细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用与原先提供的培养条件不同的培养基，可能造成细胞形态发生变化或无法存活，以及细胞的表型功能丢失。

2.细胞发生微生物污染时，应如何处理？ 

直接丢弃或更换，将未受污染的细胞转移至其它培养箱，并用消毒剂消毒培养器皿和超净台以及二氧化碳培养箱。如发生真菌霉菌污染，需用紫外灯照射整个细胞间，从而消除可能产生的孢子。同时排除使用试剂的污染，包括培养基和血清，可以空培试验。

3.为何培养基用一段时间后，颜色偏紫？

培养基随着多次开盖会使培养液CO2 逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性从而变紫，尤其是剩余的培养基越少越容易变紫。可将培养瓶瓶盖旋松放入二氧化碳培养箱校正溶液PH值，过一段时间就会变回正常。变紫的培养基是可以继续使用的，培养细胞时在培养箱会自动恢复颜色。

4.细胞培养液变黄变浑，如何处理？

细胞培养液变黄多半是细胞密度过大，细胞增殖速度过快，产生大量酸性代谢废物，导致细胞营养不足。而培养液变浑多半是发生了细菌污染。出现这种情况应立即进行消化传代处理。

5.血清中出现的沉淀是什么，有影响吗？

① 纤维蛋白，是经常出现的较大沉淀物，可达到1-2mm，用肉眼可观察到；

② 胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质，是血清出现沉淀物的常见原因；

③ 磷酸钙，也是一种常见沉淀物，通常会使血清出现浑浊，并且在37℃培养时会增加。这种沉淀物在倒置显微镜下观察像小黑点，这些小黑点由于布朗运动看上去可以活动，因此经常被误认为是微生物污染。

这些沉淀对细胞的生长是没有影响的，如想去除沉淀，尽量采用离心方法，不建议使用过滤方法，因为会堵塞滤膜而且会造成污染的风险。

6.细胞何时换液最佳？

①细胞消化传代后，建议隔天或隔两天换一次液；

②细胞传代后，发现碎片多、死细胞多，在细胞形态已经形成的前提下可第二天换液；

③对于生长速度较慢的细胞，可多放点培养基，减少换液次数，让细胞静养；

④细胞传代后，细胞分布不均、细胞堆叠、细胞间隙大、局部密度大，这些情况下不用换液，可采取消化重铺的方式。

7.细胞支原体污染如何处理？

支原体污染是比较难去除的，特别容易复发，一般建议直接更换新的细胞，如特别精贵或重要的细胞可尝试使用四环素、大环内酯类抗生素（泰乐霉素）、喹诺酮类抗生素。

8.如何控制胰酶消化时间？

胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤。消化过度，细胞碎片增多，黑渣子增多，细胞会成片脱落，严重影响细胞活性，导致部分细胞漂浮；消化不足，则细胞难于从瓶壁脱落，反复吹打同样也会损伤细胞活性。

不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。像疏松贴壁的293T和Lncap可能1-2min，正常贴壁的Hela和A549可能2-3min，贴壁较牢的HEPG2和CACO-2可能5min，贴壁非常牢的5637和A431可能10min左右。具体消化时间以消化到细胞变圆收缩、细胞间隙变大、轻轻晃动培养瓶能看到细胞呈流沙状即可终止。

9.如何避免血清沉淀物的产生? 

①解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)；

②解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生；

③请勿将血清置于37℃太久，否则会变混浊，同时许多较不稳定的成分也会因此受到损害，从而影响血清质量。

血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可无须做此步骤。

10.对细胞形态有疑问？

①确定细胞所使用的培养基种类是否为说明书建议的。改变培养基种类细胞形态可能会有变化；

②以引种公司官网细胞照片为准，其次可以参考ATCC或DSMZ网站的图片；

③如上皮型细胞明显成为成纤维细胞，或成纤维细胞明显成为上皮型细胞，需查看细胞是否提供STR鉴定报告，身份是否正确；

④细胞的代次是否过高导致分化变异、细胞是否经过加药诱导、细胞是否经过转染等都会引起细胞形态发生变化；

⑤细胞低密度和高密度形态不一，还有一些细胞呈现形态较慢，细胞要1-2天才能伸展开。所以细胞的正常形态要等细胞密度起来后才能确定。