流式细胞术(FCM)

发布时间：2023-09-26

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)能够快速测定细胞悬液中单个细胞的生物学性质，并可以对特定的细胞进行分选收集。广泛用于细胞生物学，免疫学，遗传学，基础医学等领域。高速客观、结果稳定、具有统计学意义，能够处理复杂样本并同时获取多种参数，是它的特点和优势。那么，流式细胞的基础实验流程该如何做？博士德将多年来的实操经验分享给大家。

FCM实验操作视频

细胞固定→细胞破膜→封闭→一抗孵育→二抗孵育→上机检测

注：本视频以博士德公司抗体Anti-ROCK1 Antibody（产品货号：A00722-4）为例，使用破膜剂处理，间接法的流式细胞检测流程。

FCM实验产品清单

FCM实验操作流程

第一步：样品细胞的固定

1.  将单细胞悬液1100rpm 离心5min；

2.  去上清；

3.  加入1mL的4%多聚甲醛固定液(AR1069)，混匀；

4.  将细胞及固定液转移至1.5ml离心管；

5.  4℃固定20min；

6.  将固定后的细胞3000rpm离心1 min；

7.   弃上清；

8.   加入1ml DPBS(PYG0123)，混匀（此过程清洗2次后备用）。

注意事项：

1.  新鲜样本应及时处理保存；

2.  根据实验目的选择最佳固定方法，避免固定剂的原因，造成检测结果的不稳定，未固定的样本尽量立即实验，固定的样本一个月内实验。

第二步：细胞破膜

1.  设置空白组、同型对照组、抗体检测组；

2.  弃上清；

3.  将细胞样本中加入300ul破膜剂，混匀；

4.  分装至空白组、对照组、检测组各100ul。

注意事项：

1.  实验前需了解蛋白在细胞/正常组织/癌变组织中的表达情况，来确定后续实验的样本选择和是否破膜处理；

2.  检测指标为膜抗原，不需破碎细胞膜，加入DPBS缓冲液(PYG0123)（部分膜指标不能固定）；

3.  检测指标为细胞浆、膜、分泌类抗原，样本经固定，应加入破膜剂；

4.  检测指标为核抗原，样本经固定，应加入破核膜试剂；

5.  设置空白对照管来区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性结果；

6.  设置同型对照管来消除非特异性结果到细胞上而产生的背景荧光。

第三步：封闭

1.  空白组、对照组、检测组分别加入5μL浓缩型山羊血清(AR1009)，混匀；

2.  室温孵育10min。

第四步：一抗孵育

1.  对照组加入1ul兔IgG(BA1045)，混匀；

2.  检测组加入1ul抗体(A00722-4)，混匀；

3.  37℃孵育40min (可间隔20分钟轻晃混匀样本)；

4.  3000rpm离心1min；

5.  弃上清；

6.  加1mL DPBS(PYG0123)，混匀；

7.  3000rpm离心1min；

8.  弃上清；

9.  加100μL洗液，混匀。

注意事项：

若是膜表达，则清洗离心后加入DPBS(PYG0123)。ISO同型对照使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照

第五步：荧光二抗孵育

1.  加1ul荧光标记羊抗兔IgG (BA1127)，混匀；

2.  37℃避光孵育40min(可间隔20分钟轻晃混匀样本)；

3.  3000rpm离心1min；

4.  弃上清；

5.  加1ml DPBS(PYG0123)，混匀；

6.  3000rpm离心1min；

7.  弃上清；

8.  加100μL DPBS(PYG0123)，混匀。

第六步：上机检测

1.  空白组、对照组、检测组分别上机采样；

2.  采集数据；

3.  分析结果。

注意事项：

荧光易衰减，实验完成后尽快上机检测。

FCM实验常见问题

1.  样品处理需要注意哪些？

未固定的样本应立即实验，根据实验目的选择最佳固定方法，避免因固定剂造成检测结果不稳定。新鲜组织标本应及时处理保存，以免在室温下放置时间过长，导致组织坏死及细胞自溶，从而影响检测结果。

2.  流式样品制备后可保存多久？

深低温保存法（一年）；乙醇或甲醇保存法（2周）；甲醛或多聚甲醛保存法（2月）。

3.  什么是空白对照？

空白对照就是不进行任何标记的细胞，主要目的是用于测定基础荧光信号表达值。设置空白对照管（未染色的细胞）来区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。

4.  什么是同型对照？

同型对照就是与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照。设置同型对照管，消除抗体非特异性结合到细胞上从而产生的背景荧光。

5.  如何确定样品是否需要破膜？

可通过蛋白信息数据库或其他文献查询蛋白在细胞/正常组织/癌变组织中的表达情况，以确定后续实验中该选取什么样品（细胞）来进行实验，以及是否使用破膜剂/破核膜剂来处理样品（细胞）。

6.  流式染色时间和温度如何选择？

流式染色是抗原抗体的结合反应，该过程结合非常快，而且非常牢固，但染色过程要尽量让所有抗原都能结合抗体分子，所以加入抗体时一定要混匀，我们一般选择室温染色15 min或者4℃染色30 min，染色中途混匀一次，建议轻弹管子（枪头吹打可能会对细胞受损，死细胞增多，导致非特异性结合增加）。

7.  流式上样速度如何选择？

一般建议上样速度控制在10000个/秒以内，上样速度太高，容易堵塞吸样针，并且会导致检测不准确。

8.  收集的细胞通过流式仪检测时，一般多少细胞量合适？

进⾏流式检测时，⾄少需要记录5000个活细胞，⼀般调整细胞密度⾄1*106/100ul进⾏流式检测。

9.  FCM检测过程中如何设门（gating）？

⼀般根据散射光进⾏设门，即我们通常所说的前散（forward scatter, FSC）和侧散（side scatter, SSC）来设门。FSC的⼤⼩与细胞的直径成正相关，不同的细胞，细胞越⼤，其FSC越⼤；反之越⼩。SSC的⼤⼩与细胞内颗粒结构的质量成正相关，不同的细胞，细胞内颗粒结构越复杂，质量越⼤，其SSC越⼤；反之越⼩。

10.  如何减少补偿的干扰？

因为不同激光器激发的荧光染料之间几乎没有补偿的干扰，所以对于多激光器的仪器我们可通过选择不同激光器激发的染料来避免补偿的干扰，选择同一激光器激发的染料是，尽量选择染料之间发射光谱不重叠的染料。

11.  FCM检测过程中如何调节补偿？

在FCM检测过程中，如果存在多⾊，则必须进⾏荧光补偿调节。调节补偿⾸先要知道双阴性细胞的情况，其次，必须要⽤单阳和双阴性细胞。只有在有阴性细胞作为参照的情况下，才能既不会过多⼜不会过少地调节补偿。

12.  FCM检测时，如果存在多⾊分析，应该如何进⾏配⾊呢？

在FCM检测过程中，如果存在多⾊分析，虽然可以通过荧光补偿来消除荧光光谱重叠的影响。但调节补偿过⼤在⼀定程度上仍然会影响测值的准确性，因此，我们⼀般建议尽量选择荧光光谱重叠少的荧光抗体组合。

13.  细胞内染色选用什么样的荧光素？

对于胞内染色，应选用分子量较小的荧光素。

14.  目标蛋白不存在或处于低水平表达怎么办？

确保组织或细胞类型表达的目标蛋白处于一个足够检测的量。

15.  补偿过高或增益过低导致无信号/荧光弱怎么办？

使用阳性对照再次设置补偿或在合理的范围内提高增益以增强信号。

16.  过量抗体被困导致荧光强度过高怎么办？

这是细胞内染色特有的问题，较大的荧光分子使抗体被困在细胞中。确保洗涤步骤充分，包括在洗涤缓冲液中加入吐温或Triton。