免疫组化(IHC)

发布时间：2023-09-26

免疫组织化学（IHC）实验是通过组织染色来显示蛋白质的有无、定位以及含量变化的病理学常用技术，是许多实验室的主要免疫测定方法。病理实验看似容易，但在实验过程中存在许多变量，真正想做好需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。博士德将以多年来的实操经验分享给大家。

IHC实验操作视频

取材固定→切片→脱蜡至水→灭活→抗原修复→封闭→一抗孵育→二抗孵育→显色→复染→封片

注：视频中以博士德PCNA（货号BM0104）内参抗体为例。

IHC 实验产品清单

IHC 实验操作步骤

第一步：切片

1. 石蜡切片厚度5微米；

2. 40℃水温展平组织后防脱玻片捞片；

3. 60℃烘箱，烤片30min。

注意事项：

对于骨或皮肤这些易脱片的组织，可适当延长烤片时间。

第二步：脱蜡至水

1. 二甲苯脱蜡，3缸，每缸10min；

2. 100%、85%、70%酒精，各浸泡10min。

注意事项：

具体时间需根据室温和二甲苯的新旧程度灵活调整，室温越高，二甲苯越新，相应浸泡时间越短，以组织上无点状石蜡残留为准。

第三步：灭活 

1. 滴加内源性过氧化物酶阻断液；

2. 室温孵育10min；

3. PBS缓冲液水洗3次，每次5min。

注意事项：

对于内源性过氧化物酶含量高的组织，可以适当延长孵育时间或增加过氧化氢浓度。

第四步：抗原修复

EDTA微波热修复5~8min，冷却至室温。

注意事项：

对大部分蛋白来说，EDTA修复液一般都能得到满意的结果。也可使用传统的柠檬酸盐修复液。样本固定时间过久或阳性表达不强，可以适当增加修复的次数和强度。

第五步：封闭

1. 免疫组化笔画圈，防止试剂流出；

2. 滴加5%BSA或者封闭血清；

3. 37℃孵育30min。 

第六步：孵育一抗

1. 甩去多余液体，不洗，直接滴加一抗；

2. 37℃孵育1-2h；

3. PBS缓冲液清洗3遍，每次5min。

注意事项：

初次实验，建议一抗做浓度梯度，以确定最佳的一抗稀释比例。

第七步：孵育二抗

1. 滴加HRP标记羊抗兔；

2. 37℃孵育30min；

3. PBS缓冲液清洗3遍，每次5min。

注意事项：

根据一抗种属决定二抗的类型，比如一抗为兔抗，那二抗选择HRP标记的羊抗兔IgG。

第八步：显色

1. 配置DAB，1ml B液+1滴A液，混匀；

2. 滴加DAB显色液；

3. 镜下观察，控制显色时间；

4. 终止反应；

5. 水洗。

第九步：苏木素复染

1. 苏木素复染40s；

2. 蒸馏水水洗；

3. 返蓝液浸泡1min；

4. 水洗。

第十步：封片

1. 70%、85%、100%酒精梯度脱水，每缸3min；

2. 二甲苯透明，三缸，每缸3min；

3. 晾干后，中性树胶封片，观察实验结果及拍照。

IHC 实验常见问题

1.无染色

2.高背景

3.   非特异性染色