酶联免疫吸附试验(ELISA)

发布时间：2023-09-26

ELISA因其敏感性高、特异性强等特点，被广泛用于临床或科研中抗原和抗体的检测。ELISA 实验操作相对简单，但小实验蕴含大道理，细节稍不注意很容易产生假阳性或假阴性。接下来，博士德将以预实验的方式为大家演示ELISA具体实验操作过程。

ELISA实验操作视频

标准品溶解→样本稀释及加样→加抗体→洗板→加ABC →洗板→加TMB显色→加终止液→数据处理  

注：视频中以博士德Human Adiponectin （货号EK0595）ELISA试剂盒为例。

提示：

1. 检查试剂盒各个组分和规格是否与说明书一致；

2. 生物素标记抗体、亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)离心。

3. ELSIA样本处理、详见附件: ELISA样本处理.pdf

ELISA 实验操作步骤

第一步：标准品溶解，样本稀释及加样

1.    加1mL样品稀释液到标准品中

2.    使用漩涡器颠倒反复混匀

3.    根据说明书将标准品依次稀释7个浓度

4.    最后一孔只加样品稀释液作为零孔

5.    样本根据种类做相应的稀释

6.    本次试验以样本稀释10倍和100倍为例

7.    10倍稀释，取20uL样本加入到180uL样本稀释液中，混匀。100倍稀释，取20ul 10倍稀释的样本加入到180ul样本稀释液中，混匀。

8.    取出所需酶标板平衡至室温

9.    将稀释好的标准品和样本按每孔100uL加入酶标板

10.  加上封板膜于37℃孵育90分钟，孵育完吸取板内液体

注意事项：

1.   酶标板需平衡至室温后在加样；

2.   配完标曲后溶解的标准品按说明书进行保存；

3.   加样时第一枪吸放一次排空气泡；

4.   格按照说明温度和时间进行孵育；

5.   同时做的试剂盒多时应做好标记并避免酶标板叠放。

第二步：加抗体

1.    按1:100在使用前30分钟内配制生物素标记的抗体

2.    将准备好的生物素标记的抗体按每孔100uL加入酶标板

3.    盖上封 板膜于37℃孵育60分钟

注意事项：

1. 1条按1mL配，取10uL抗体加入990uL抗体稀释液；

2. 抗体在使用前30分钟内配制好并混匀；

3. 推荐使用排枪，避免前后时间间隔太长；

4. 每次都需要使用新的封板膜进行孵育，避免交叉污染。

第三步：洗板

反应后1X洗涤液洗3次，每孔洗液加300ul，每次浸泡1分钟。

注意事项：

1.   推荐使用自动洗板机洗板；

2.   人工洗板时，每次板孔尽量拍干；

3.   浸泡时间可根据洗板机的型号适当调整浸泡时间。

第四步：加ABC

1.   按1:100在使用前15分钟内配制ABC，配法同抗体配制

2.   准备好的A BC按每孔100uL加入酶标板

3.   盖上新的封板膜和TMB一同置于37℃反应30分钟。

注意事项：

1.  ABC在使用前15分钟内配制好并混匀；

2.  ABC孵育时将TMB一同放入37℃恒温箱平衡30分钟。

第五步：洗板

反应后1X洗涤液洗5次，每孔洗液加300ul，每次浸泡90秒。

第六步：加TMB显色

1.   按每孔90uL加入TMB显色液

2.   盖上封板膜37℃避光反应15-20分钟

注意事项：

1.   第一板加完时应将TMB盖起来避免见光；

2.   倒出来的TMB没用直接倒掉，不可回收利用；

3.可根据具体显色情况适当提前或推后显色时间。

第七步：加终止液

1.   反应后每 孔加100uL终止液

2.    酶标仪选择450nm读数

注意事项：

1.   加终止液时枪头应在液面上方，避免交叉污染；

2.   加液速度不宜太慢，防止出现假阳性。

第八步：数据处理（以正实验后处理结果为例）

注意事项：

1.  建议采用四参数曲线对数据进行拟合；

2.  曲线R值一般不低于两个9。

ELISA 实验常见问题

1.信号弱

2.背景高

3.无信号

4.梯度稀释时出现跳孔现象

5.标曲佳但样本孔无信号或信号偏高

6.边缘效应