酶联免疫吸附试验(ELISA)

发布时间：2023-09-26

ELISA因其敏感性高、特异性强等特点，被广泛用于临床或科研中抗原和抗体的检测。ELISA 实验操作相对简单，但小实验蕴含大道理，细节稍不注意很容易产生假阳性或假阴性。接下来，博士德将以预实验的方式为大家演示ELISA具体实验操作过程。

ELISA实验操作视频

双抗夹心法ELISA：标准品溶解→样本稀释及加样→加抗体→洗板→加ABC →洗板→加TMB显色→加终止液→数据处理  

注：视频中以博士德Human Adiponectin （货号EK0595）ELISA试剂盒为例。

提示：

1. 检查试剂盒各个组分和规格是否与说明书一致；

2. 生物素标记抗体、亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)离心。

3. ELSIA样本处理、详见附件: ELISA样本处理.pdf

ELISA 实验操作步骤

第一步：标准品溶解，样本稀释及加样

1. 加1mL样品稀释液到标准品中，使用漩涡器颠倒反复混匀，使用前2h内准备；
2. 根据说明书将标准品依次稀释7个浓度，最后一孔只加样品稀释液作为零孔；
3. 样本根据种类做相应的稀释，以10倍稀释为例，取20uL样本加入到180uL样本稀释液中，混匀；
4. 取出所需酶标板平衡至室温，将稀释好的标准品和样本按每孔100uL加入酶标板，加上封板膜于37℃孵育90分钟，孵育完吸取板内液体。
注意事项：
1. 标准品在使用前2h内准备；
2. 酶标板需平衡至室温后在加样；
3. 配完标曲后溶解的标准品按说明书进行保存；
4. 加样时第一枪吸放一次排空气泡；
5. 格按照说明温度和时间进行孵育；
6. 同时做的试剂盒多时应做好标记并避免酶标板叠放。

第二步：加抗体
1. 按1:100在使用前2h配制好生物素标记的抗体，轻轻混匀；
2. 将准备好的生物素标记的抗体按每孔100uL加入酶标板，盖上封板膜于37℃孵育60分钟。
注意事项：
1. 1条按1mL配，取10uL抗体加入990uL抗体稀释液；
2. 推荐使用排枪，避免前后时间间隔太长；
3. 每次都需要使用新的封板膜进行孵育，避免交叉污染。

第三步：洗板
反应后1X洗涤液洗3次，每孔洗液加300ul，每次浸泡1分钟。
注意事项：
1. 推荐使用自动洗板机洗板；
2. 人工洗板时，每次板孔尽量拍干

第四步：加ABC
1. 按1:100在使用前1h内配制ABC工作液并轻轻混匀；
2. 准备好的ABC按每孔100uL加入酶标板，盖上新的封板膜和TMB一同置于37℃反应30分钟。
注意事项：
ABC孵育时将TMB一同放入37℃恒温箱平衡30分钟。

第五步：洗板
反应后1X洗涤液洗5次，每孔洗液加300ul，每次浸泡90秒。

第六步：加TMB显色
1. 按每孔90uL加入已37℃平衡30min的TMB显色液；
2. 盖上封板膜37℃避光反应15-20分钟，颜色变蓝。
注意事项：
1. 加TMB时注意避免强光直射；
2. 可根据具体显色情况适当提前或推后显色时间，以肉眼可见标准品前4孔梯度蓝色为准。

第七步：加终止液
反应后每孔加100uL终止液，此时液体蓝色立即转黄。
注意事项：
1. 加终止液时枪头应在液面上方，避免交叉污染；
2. 加液速度不宜太慢，防止出现假阳性。

第八步：结果分析
立即用酶标仪在450nm测定0D值，用软件绘图，计算结果。
注意事项：
1. 有两种设定空白对照的方案：
   ① 将TMB空白显色孔 (只加TMB显色液和终止液) 设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB 空白显色孔的吸光值；
   ② 将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
2. 将得到的数值以标准品浓度作为横坐标，吸光值作为纵坐标，用软件绘图并选取最佳拟合曲线，选择四参数或五参数拟合法往往曲线拟合效果较好。
3. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。若标本OD值高于标准 曲线上限，应适当稀释后重测，应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

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